PCR是一種能夠在短時間內(nèi)將單個DNA分子擴(kuò)增數(shù)百萬倍的生化過程。其擴(kuò)增過程包括三個連續(xù)步驟:變性,對雙鏈DNA模板進(jìn)行加熱,使其解離;退火,被稱為引物的短DNA分子與目標(biāo)DNA的側(cè)翼區(qū)域結(jié)合;延伸,DNA聚合酶沿著模板鏈將引物3’端進(jìn)行延伸。多年以來,PCR的基本原理一直未變,但隨著 DNA聚合酶和試劑性能的大幅提升,以及儀器和塑料反應(yīng)管的不斷創(chuàng)新,PCR實驗方法也在不斷改進(jìn)。那么你知道PCR實驗的七大要素嗎?讓我們一起來看看吧!
一、DNA聚合酶
DNA聚合酶是PCR的重要組成部分,它們能夠從單鏈DNA模板合成新的互補鏈。所有DNA聚合酶都具有5′→ 3′聚合酶活性,即摻入核苷酸并使引物從按5'至3’方向延伸。
早期的PCR,通常使用來源于 大腸桿菌 的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 來生成新的子鏈。但是,這種 大腸桿菌酶對熱敏感,易受到變性階段高溫度的破壞,從而無法繼續(xù)進(jìn)行退火和延伸步驟。因此,需要在全程每個循環(huán)的退火步驟中重新補充酶。
二、熱循環(huán)儀
熱循環(huán)儀是一種能夠為PCR反應(yīng)自動完成溫度循環(huán)和孵育的儀器。在引入熱循環(huán)儀之前,PCR反應(yīng)是一個費時費力的過程,需在不同溫度的水浴之間轉(zhuǎn)移樣品,并為每個步驟需要精確定時。
三、模板DNA
用于復(fù)制的PCR模板可以是任何DNA來源,如基因組DNA(gDNA)、互補DNA(cDNA)和質(zhì)粒DNA。
四、引物
PCR引物是含有15-30個堿基的合成DNA寡核苷酸。能夠與模板DNA中目標(biāo)區(qū)域的側(cè)翼序列結(jié)合(通過序列互補)。在PCR反應(yīng)期間,DNA聚合酶從 3′端開始延伸引物。因此,引物結(jié)合位點必須是靶標(biāo)附近所有的,并且與起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性,以確保目的片段的特異性擴(kuò)增。
五、脫氧核苷三磷酸(dNTP)
dNTP由四個基本核苷酸組成——dATP、dCTP、dGTP和dTTP——是新DNA鏈的組成元件。這四種核苷酸通常以相等摩爾量加入到PCR反應(yīng)體系中,以實現(xiàn)最佳的堿基引入。但是,在某些情況下,如通過PCR方法進(jìn)行隨機(jī)突變,偶爾也會使用濃度不等的dNTP,以促進(jìn)非校正DNA聚合酶產(chǎn)生更多的錯誤堿基插入。
六、鎂離子(Mg2+ )
鎂離子(Mg2+ )作為DNA聚合酶活性的輔助因子,有助于聚合期間dNTP的結(jié)合。酶活性位點處的鎂離子可催化引物的3′-OH與dNTP的磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵。此外, Mg2+ 能夠穩(wěn)定磷酸鹽骨架上的負(fù)電荷,從而促進(jìn)引物與DNA模板形成復(fù)合物
七、緩沖液
PCR緩沖液能夠為DNA聚合酶活性提供適宜的化學(xué)環(huán)境。緩沖液pH通常為8.0-9.5,一般使用Tris-HCl來調(diào)節(jié)。
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